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新手必备 | 手把手教你做蛋白免疫共沉淀。
蛋白免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
实验原理
免疫共沉淀的原理是使用靶蛋白特异性抗体间接捕获与特定靶蛋白结合的蛋白来鉴定体内相关的蛋白-蛋白相互作用。具体来说，当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。此时，如果加入特异性抗体，抗体可以和已知的抗原（即靶蛋白）形成抗原-抗体复合物。如果在系统中存在与已知抗原相互作用的蛋白质，该蛋白质也会以复合物的形式沉淀下来。经过洗脱后，可以得到与已知抗原相互作用的蛋白质，再进行SDS-PAGE及Western blotting分析。
操作攻略
转染后24~48小时可收获细胞，加入适量RIPA细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30分钟。细胞裂解液于4°C、最大转速离心30分钟后取上清。
取少量裂解液以备Western blot分析（Input），剩余裂解液加1μg相应的抗体到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；对照组直接加入跟所用抗体同种型对照。
取10μl protein A琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3000rpm离心3分钟。
将预处理过的10μl protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中，4°C缓慢摇晃孵育2~4小时，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连。
免疫沉淀反应后，在4°C以3000rpm速度离心3分钟，将琼脂糖珠离心至管底；小心吸去上清，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3~4次；最后加入15μl的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟。
进行SDS-PAGE、Western blotting或质谱仪分析，通过免疫共沉淀确定结合蛋白。
转染后24~48小时可收获细胞，加入适量RIPA细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30分钟。细胞裂解液于4°C、最大转速离心30分钟后取上清。
取少量裂解液以备Western blot分析（Input），剩余裂解液加1μg相应的抗体到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；对照组直接加入跟所用抗体同种型对照。
取10μl protein A琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3000rpm离心3分钟。
将预处理过的10μl protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中，4°C缓慢摇晃孵育2~4小时，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连。
免疫沉淀反应后，在4°C以3000rpm速度离心3分钟，将琼脂糖珠离心至管底；小心吸去上清，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3~4次；最后加入15μl的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟。
进行SDS-PAGE、Western blotting或质谱仪分析，通过免疫共沉淀确定结合蛋白。
注意事项
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细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100）。
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在准备做磷酸（酯）酶实验时，不要加磷酸酯酶抑制剂。
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配制工作液时，理论上蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入，但PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
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