ES/iPS培养技术整理

2018-01-17 17:44:04 hlk 47

     目前关于ES/iPS的研究如火如荼,但是ES/iPS不好养啊!!!很多 “科研狗”每天被多能干细胞折磨得生无可恋。。。


今天我们就对ES/iPS无饲育层维持培养的一些技术信息进行一番整理。

(一)      培养基的选择

mTeSR1(# 05850)和TeSR-E8(# 05940)是目前应用最广泛的无血清、无需滋养层的ES/iPS培养基。

 

1. TeSR-E8 (# 05940):只包含8种维持人ES/iPS细胞生长的细胞因子,但仍能维持ES/iPS的正常生长。

 

2. mTeSR1(# 05850)是无饲育层培养ES/iPS的金标准培养基,主要优势有:

·         引用文献多,有超过1100篇文献;

·         已经成功用于60多种iPS细胞的维持培养; 

·         用于最前沿的科学研究, CRISPR基因编辑技术(哈佛大学)大大增加了单细胞克隆的成功率;

·         细胞死亡率降低。

·         可用于大规模悬浮培养,并且已经是GMP级别。

注意:国内某著名实验室比较了mTeSR1和TeSR-E8的单细胞克隆效率,发现mTeSR1比TeSR-E8高6倍。

 

(二)贴壁基质的选择

   ES/iPS细胞是贴壁细胞,需要在基质包被的培养皿中进行贴壁培养。目前,使用最多的贴壁基质是Corning Matrigel (# 354277)和Vitronectin XF (#07180)。

1.Corning Matrigel (# 354277)是最为常见的包被基质胶,来自于小鼠肿瘤组织,含有异种动物源成份。包被时,需要使用组织处理过的培养板。

2.Vitronectin XF (# 07180)是成份明确、无血清、无异种动物源成份的包被基质胶,与mTeSR1 (# 05850)和TeSR-E8 (# 05940)配合使用创造了一个无异种动物源成份的培养环境。包被时,需要使用未经组织处理过的培养板。

 

(三)ES/iPS细胞传代试剂的选择

当ES/iPS细胞被接种在培养板上时,在显微镜下密切监视细胞的生长状态,确定最适宜的传代时间。目前,用于传代ES/iPS细胞常见的试剂有GCDR (# 07174)、ReLeSR (# 05872)、Dispase分散酶 (# 07923)、Accutase (# 07920)等,使用不同的消化试剂对细胞消化的时间也不同。

1.温和细胞解离试剂(GCDR #07174)是一种不含酶的传代试剂,主要利用集钙作用,使细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用变松散。通过调节孵育时间和孵育温度,可将ES/iPS解离成细胞聚集体或单细胞进行常规传代。被称之为“万能解离试剂”。当以Matrigel为基质,以mTeSR1为培养体系时,孵育时间推荐为6-8分钟。传代倍数较高,一般以1:10到1:40的比例进行传代。由于使用的细胞系不同,还需根据个人实验情况进行孵育时间的优化。

2. ReLeSR (# 05872)化学成份明确、不含酶的一种解离试剂。无需手工刮擦,它可以选择性地使未分化的细胞从培养皿上解离,,生成大小最合适的聚集体。而已分化的细胞仍保留在培养皿上。可与应用密闭容器的培养过程相兼容,与mTeSR™1、TeSR™-E8™、Vitronectin XF™和Matrigel (www.nwbiotec.com)配合使用。当使用mTeSR1培养时,孵育时间推荐为5-7分钟。由于使用的细胞系不同,还需根据个人实验情况进行孵育时间的优化。

3.Dispase分散酶(# 07923):推荐用于mTeSR1(# 05850)和TeSR-E8(# 05940)培养的ES/iPS进行常规传代的传代。该酶从多粘芽孢杆菌分离的中性蛋白酶,可将纤连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白切割分离开,在很小程度上也切割I型胶原蛋白,但却不能切割Ⅴ型胶原蛋白和层粘连蛋白。胰蛋白酶和胶原酶这样的蛋白水解酶通常用于解离组织和细胞,但这些酶往往会损害细胞,且在孵育过程中很不稳定。中性蛋白酶的使用克服了这些困难。Dispase分散酶(# 07913)来自细菌,不会带来支原体或任何动物病毒的污染。酶活性不受血清的抑制,但螯合剂如EDTA、EGTA以及稀释很容易让其失去活性。当使用mTeSR1培养时,孵育时间推荐为7分钟。传代倍数相比GCDR较低,一般以1:6到1:10的比例进行传代。由于使用的细胞系不同,还需根据个人实验情况进行孵育时间的优化。。

4.Accutase(# 07920) 是一种含有胶原酶和蛋白的细胞消化液。用于标准组织培养皿和包被的培养皿中培养的细胞的常规消化。ACCUTASE™不包含哺乳动物和细菌原成份。每批ACCUTASE™都经过了无菌检测、酶活检测和细胞解离检测。使用时用PBS溶液以1:1的比例稀释。

注意:对于ES/iPS细胞的传代,最初几代传代建议尽量手动传代新的iPS细胞系(即:无化学成份、无酶),这样有助于减少其他杂细胞、未完全重编程细胞或分化细胞的污染,一旦iPS细胞系建立,则开始应用化学或酶试剂进行传代(如GCDR # 07174或ReleSR # 05872)。

 

(四)冻存液的选择

当细胞达到一定数量后,需要将细胞冻存起来。 在冻存前,尽量保证ES/iPS细胞的质量优良(基本未分化,或分化的细胞< 20%)。应在细胞可以传代前大约1天内冻存。若以较大的细胞团冻存,ES/iPS细胞在解冻后的存活率将会提高,一般以50-200 µm的团块为宜。而且选择合适的冻存液对于ES/iP的复苏率以及特征的保持都尤为重要。以下是几种推荐的冻存试剂:

1. Cryostor CS10(# 07930)是USP级别经GMP生产的的无动物源成份的冻存液,含有10%的DMSO(二甲基亚枫),开盖即用,不含内毒素。以“团块”形式冻存ES/iPS细胞。可用于冻存干细胞、免疫细胞等。

2. mFreSR(# 05855)是ES/iPS细胞的专用冻存液,以“团块”形式冻存细胞。

3.FreSR-S(# 05859)是以单细胞形式冻存ES/iPS细胞,如果采用此形式,细胞复苏后建议添加小分子Y-27632(# 72302)以提高细胞存活率。