设计实时荧光定量PCR引物方法

实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

实时荧光定量PCR是实验室最常用的实验。研究基因在mRNA表达水平,以及验证基因敲除后下游靶基因变化情况等等。对于新手来说，如何快速设计引物呢？

首先，推荐三个在线设计实时荧光定量PCR引物的网站，不用安装软件，直接上网就可搞定。

一、Primerbank

1.  首先进入网站主页，https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/。选择Keyword,根据自己需求选择种属以及基因名称。比如设计人类BCL2基因。

2.点击submit后可以看到以下界面，网站会推荐多对引物，可以根据引物长度、Tm值选择。

二、Pubmed

1. 在Pubmed网站找到BCL2基因组序列，点击FASTA获得基因序列后，将基因序列下载到桌面上。

2．点开pubmed主页上面的Blast,进入Primer-BLAST, 输入基因序列，可以根据自己实验要求选择引物长度。

3．点击Get primer之后，可以得到多对引物序列。可以根据引物长度等要求进行筛选。

三、Primerplus3

1.在Pubmed-gene获得基因序列后，在primer3plus主页上输入基因序列，网址; http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi。

2.点击general setting,设置引物扩增长度，一般可设置扩增长度偏大一些，然后根据推荐引物选取合适扩增长度。

3. 点击pick primers后，首先会看到优选推荐的一对引物，同时在序列中看到引物所在位置。Primer3plus网站中可以看到引物Tm值以及GC含量。 

最后简单介绍一下实时荧光定量PCR引物设计原则：

（1）引物长度一般在15~30碱基之间，过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

（2）引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，一般计算公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值。

（3）引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

（4）引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。

（5）引物扩增长度：一般RT-PCR引物扩增长度在100-200bp。