【技术贴】经典凋亡检测三种方法,你都知道吗?

2017-11-27 10:35:14 hlk 57

细胞凋亡是检测细胞活力及生长状态的重要指标,是细胞死亡程序中的重要一环,也是科研工作者们在基础和临床科研中常用的诊断标准。传统检测方法中,最经典的检测就是Annexin V & Dead Cell检测法。

Annexin V检测法

华联科实验中心

在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧,细胞发生凋亡早期,膜磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的。7-ADD是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,7-ADD能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。将AnnexinⅤ与PI匹配使用,可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。基于此原理,Muse™全能细胞质控仪提供优化预混试剂盒MuseTM Annexin V & Dead Cell Kit (货号:MCH100105),可以简单、快速对细胞生存状态进行评估。

 

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纳米羟基磷灰石(Nano-hydroxyapatite, Nano-HA)和纳米二氧化钛(Nano-titanium Dioxide, Nano-TiO2)是口腔清洁产品中常见的两种纳米材料。作为每天都要用的产品,这两种纳米材料对口腔上皮细胞的毒性检测是必不可少的一环。Muse™全能细胞质控仪使用其配套的优化预混试剂盒MuseTM Annexin V & Dead Cell Kit检测发现,人口腔上皮细胞分别经过两种纳米材料24小时的处理后,高浓度(1250 µM)的Nano-TiO2诱导的细胞凋亡的比例更高,这一结果为牙膏等口腔清洁用品中两种纳米材料的添加量以及毒性警示线提供真实的数据参考。

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Annexin V检测的仅仅是细胞凋亡的表观结果,这些数据并不涉及到凋亡的信号通路研究。随着科学研究的不断深入,单纯的的Annexin V方法已经无法满足科研的需要,也不再是研究细胞凋亡的唯一标准。凋亡的细胞通路研究也逐渐成熟,Muse™全能细胞质控仪针对凋亡的检测方法和试剂盒也不断地完善。涉及到细胞凋亡的机制及信号通路如下:

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Caspase家族检测法

 

凋亡最少包含两步蛋白水解过程,其目的在于激活蛋白水解酶,进而水解细胞蛋白,最终导致细胞的裂解死亡。这一过程中涉及到的蛋白水解酶通常指的是Caspases,且这一过程中相关蛋白仅裂解而非降解。Caspase家族主要包含两类14种成员:启动型Caspases(initiator; Caspases 2, 8, 9, 10 & 12)和效应型Caspases(effector; Caspases 3, 6 & 7)。

 

Muse™全能细胞质控仪配套的Muse™ MultiCaspase Kit主要检测细胞总Caspases的活性(Caspases1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, and 9),加入DNA染料7-ADD用于检测死亡细胞; 可以同时对细胞Caspases信号通路的激活情况及细胞死亡进行检测。

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与Muse™ MultiCaspase Kit类似,Muse™全能细胞质控仪还设计了一套专门用于检测Caspase-3/7的试剂盒Muse™ Caspase-3/7 Kit。通过使用Muse™ Caspase-3/7 Kit检测发现,晚期肾上腺皮质癌的一线治疗药物Mitotane是通过激活Caspase 3/7进而诱导癌细胞凋亡。

 

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线粒体膜电位检测法

线粒体在细胞凋亡中起着重要作用。线粒体在呼吸氧化过程中,将所产生的能量以电化学势能储存于线粒体内膜,在内膜两侧造成质子及其他离子浓度的不对称分布而形成线粒体膜电位。线粒体膜电位的改变会导致线粒体内部分蛋白释放到胞浆中,这些蛋白通过与凋亡相关蛋白结合,从而诱导细胞凋亡。Muse™ MitoPotential Kit将线粒体膜电位染料和DNA染料相结合,用于检测与线粒体膜电位改变诱导的细胞凋亡。

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