Western blot菜鸟问题集get

︶条带呈笑脸状

凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高

︵ 条带呈皱眉状

可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全

拖尾

样品溶解不好

纹理（纵向条纹）

样品中含有不溶性颗粒

条带偏斜

电极不平衡或者加样位置偏斜

条带两边扩散

加样量过多

抗体浓度太高

1.一抗或二抗浓度太高会导致高背景，降低抗体浓度

使用的封闭液不兼容

1.对比不同的封闭缓冲液

非特异性位点封闭不足

1.优化封闭缓冲液，最好的封闭缓冲液具有系统依赖性

2.提高封闭液中蛋白的浓度

3.优化封闭时间和/或温度。室温封闭至少1 h或者4°C封闭过夜

4.在封闭液中加入Tween-20，Tween-20的终浓度为0.05%

封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应

1.换一种不同的封闭液

2.不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭，牛奶含生物素

3.交叉反应的检测。封闭一张干净的膜，与抗体一起孵育，然后用超感应化学发光底物检测

洗涤不充分，增加洗涤次数和使用缓冲液的体积

1.降低HRP结合物的浓度

2.如果洗涤液中无Tween-20，添加Tween-20使其终浓度为0.05%

膜的曝光时间过久

1.缩短印迹膜曝光到胶片的时间

2.按照说明书的指示，保证膜始终是湿润的

3.用一张新膜

4.保证膜完全被液体覆盖，避免其干燥

5.在孵育过程中始终进行震荡

6.小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合

7.不能空手持膜，始终带干净手套或用镊子

缓冲液污染或结块沉淀

1.制备新的缓冲液

抗体浓度太高

1.若一抗和/或二抗浓度过高会产生高背景，降低抗体浓度

HRP处产生聚集体

1.用0.2 μm过滤器过滤结合物

结合可产生斑点

1.用一种新的高质量的结合物

缓冲液中有污染

1.使用新的缓冲液

2.缓冲液使用前过滤

操作设备被污染

1.保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁，无外缘污染物

2.保证在转膜后没有凝胶留在膜上，蛋白可能黏在胶上导致背景