肝缺血再灌注模型(HIRI)构建浅谈

2022-03-29 15:52:02 hlk 2408

简介


1960年,Jennings首先提出缺血再灌注损伤的概念,即缺血器官、组织重新获得血液供应,不仅不能使组织、器官功能恢复,反而加重了功能代谢障碍及结构破坏,这种现象称之为缺血再灌注损伤。

在传统的肝脏肿瘤切除、肝内胆管结石、肝破裂手术中,为防止大量出血及影响术中视野,需要暂时性、选择性阻断入肝血流,但术后患者可能有食纳差、乏力、皮肤巩膜黄染等临床表现,肝功能进行性下降,肝衰竭等并发症。究其原因,一定条件下恢复肝组织血氧供应后,肝组织功能代谢障碍及结构破坏进一步加剧的过程,即为肝缺血再灌注损伤(HIRI)

一直以来,HIRI在一定程度上制约肝脏外科手术特别是肝移植手术的发展,针对HIRI机制及预防治疗措施的研究是肝脏外科的研究热点之一。







  模型制备


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SD大鼠,雄性,8~10周龄。

术前准备:SD大鼠术前禁食12h


建立70%肝缺血再灌注模型:

1、3%异氟烷气体麻醉,麻醉成功后,采取仰卧位,用棉线将大鼠四肢和头部固定在实验板上;

2、备皮,75%酒精消毒,铺单;

3、取剑突至上腹部纵行正中切口5cm,用镊子夹起腹部皮肤,依次切开、止血,注意避免损伤剑突;

4、腹膜用湿纱布保护,使用腹腔撑开器、小拉钩充分显露肝脏及胃肠道,将肝周围韧带分离;

5、解剖肝门,钝性分离出支配肝左、中叶的肝蒂后,迅速以小号无损伤动脉夹闭;

6、肝左中叶颜色由红色逐渐转为苍白或土灰色,而肝右肝叶颜色无明显变化,说明肝血流阻断成功;

7、阻断45min后移除血管夹,见肝左中叶颜色逐渐红润,说明肝脏再灌注成功。再灌注期间缝合关闭腹腔。


下图为阻断左、中叶肝蒂前、后及再灌注后肝脏颜色变化:


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HIRI 24h肝脏解剖图:

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HIRI缺血45min再灌注1-28D HE染色:

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Sham组大鼠肝索排列规则呈放射状,肝细胞和肝窦内皮细胞形态正常。

HIRI1-3d凝固性坏死,大量血窦膨胀,红细胞渗出到肝锁,嗜伊红细胞增多,严重坏死,失去肝脏结构,肝索崩解,出血,嗜中性粒细胞渗入。7-14d细胞质空泡化,病灶核固缩,窦扭曲不规则,肝细胞不同程度水肿及气球样变,可波及整个肝小叶。21-28d逐渐趋向自愈,肝索排列轻度紊乱。


SD大鼠HIRI缺血45min再灌注1-28D ALT、SOD、TNF-a、MDA指标含量变化:

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缺血再灌注损伤时,氧自由基产生和清除之间的动态平衡被打破,机体清除自由基能力减弱,致使组织中脂质过氧化产物大量蓄积,从而加重炎症反应。SOD是机体清除氧自由基的主要物质,反映生物体对抗脂质过氧化损伤的能力。MDA是脂质过氧化反应的代谢产物,可造成细胞脂质过氧化损伤。与假手术组比较,模型组大鼠术后肝脏SOD活性下降,MDA含量增高,表明缺血再灌注损伤后机体内氧自由基未能有效清除,导致细胞膜脂质过氧化,损伤肝细胞。


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  HIRI相关方向研究(摘自相关文献)


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1、在“AMPK激动剂预处理对肝缺血再灌注损伤大鼠模型的影响及相关机制”中,HIRI 12h、24h、72h后,实验组大鼠肝小叶结构较假手术组紊乱,肝索断裂,部分肝细胞出现水肿、空泡样变性及少许坏死导致的气球样变,中央静脉及肝血窦扩张、充血,肝索断裂,缺血再灌注后24h,对照组与实验组肝组织损伤较12h加重,对照组见肝小叶结构紊乱进一步加重,肝细胞水肿、空泡样变性及坏死增多,中央静脉及肝血窦扩张、充血明显,汇管区可见少许炎症细胞浸润。


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2、HIRI 4h后,表明HIRI发生时,肝脏产生大量ROSEUP减弱了I/R引起的ROS的上升。与假手术组相比,IR组观察到大量红色荧光,说明HIRI发生时肝脏产生大量ROS,而EUPH组红色物质明显减少。

“Anti-Inflammatory and Antioxidant Effect of Eucommia ulmoides Polysaccharide in Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury by Regulating ROS and the TLR-4-NF-κB Pathway”


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3、I/R损伤是肝移植的一大挑战。严重的I/R损伤直接导致术后挑战性并发症甚至移植失败。如何减轻肝I/R损伤一直是肝移植领域的研究热点。在过去的几十年里,基础和临床研究都致力于开发一种新的策略来预防肝I/R损伤,但仍缺乏显著有效的治疗方法。在“25-Hydroxycholesterol mitigates hepatic ischemia reperfusion injury via mediating mitophagy”一篇中,相关研究表明25HC预处理可减轻肝I/R损伤,有望成为一种新的临床干预手段。


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4、“Ischemia/Reperfusion Accelerates the Outgrowth of Hepatic Micrometastases in a Highly Standardized Murine Model”一篇中,构建结肠癌肝转移的肝缺血再灌注损伤模型,通过caspase-3的免疫组化发现:在对照组中肝叶中很少观察到凋亡的肝细胞。然而,在I/R的肝叶中,坏死组织区域周围的肝细胞中检测到高表达caspase-3染色。这些细胞被发现与浸润淋巴细胞的存在密切相关。


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结肠癌肝转移瘤后I/R对肿瘤的生长速率影响:


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  总结


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采取阻断70%大鼠肝脏血流缺血45分钟以上建立的肝缺血再灌注模型,结合肝脏组织学以及Suzuki's评分来看,在缺血再灌注不同时间后均出现了不同程度的炎性细胞聚集,肝细胞的坏死。模型组在7d后,ALT、SOD、TNF-a、MDA等指标逐渐恢复自愈。


为提高术后成活率,造模中应注意:

1、大鼠术前应禁食不禁水12h,避免术中胃肠道的干扰;

2、腹中切口尽量小,避免不必要的损伤;

3、分离肝蒂时要非常小心,钝性分离,否则易引起大出血,休克死亡;

4、尽量少干扰其他组织,尤其注意不可损伤肝蒂下方的下腔静脉;

5、夹闭时要一次完成,否则容易出现缺血预适应,影响模型;

6、缺血期应注意保持腹腔充分水化,用湿纱布覆盖暴露部位;

7、术中、术后都应将大鼠放置在保温毯上充分保暖;

8、关腹前腹腔内补液1ml,利于术后恢复。


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相关文献



1.Bilt J V D, Velde E T, Nijkamp M W, et al. Ischemia/reperfusion accelerates the outgrowth of hepatic micrometastases in a highly standardized murine model[J]. European Journal of Gastroenterology & Hepatology, 2006, 18(1):A3.

2.Lim C, Broqueres-You D, Brouland J P,et al. Hepatic ischemia-reperfusion increases circulating bone marrow-derived progenitor cells and tumor growth in a mouse model of colorectal liver metastases[J]. Journal of Surgical Research, 2013, 184(2):888-897.

3.卿雍成.依达拉奉对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究[D].南华大学.

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5.Cao Q, Luo J, Xiong Y, et al. 25-Hydroxycholesterol mitigates hepatic ischemia reperfusion injury via mediating mitophagy[J]. International Immunopharmacology, 2021, 96(2): 107643.

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7.Gao W, Feng Z, Zhang S, et al.Anti-Inflammatory and Antioxidant Effect of Eucommia ulmoides Polysaccharide in Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury by Regulating ROS and the TLR-4-NF-κ B Pathway[J]. BioMed Research International, 2020, 2020:1-11.